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Small RNA测序

发布日期:2018-01-26 浏览次数:192

小RNA是一类重要的体内调节分子,主要包括miRNA、piRNA和siRNA。它的功能主要是诱导基因沉默,参与基因转录后调控,从而调节细胞生长、分化,以及个体发育、生殖等重要生物学过程。小RNA测序技术采用胶分离技术,收集样品中18-30nt的RNA片段,利用高通量测序技术,一次性获得单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息,依托强大的生物信息分析平台,鉴定已知小RNA,并预测新的小RNA及其靶标基因。

技术优势

通量高:一次测序得到500万条以上的序列;

分辨率高:可以检测小 RNA单个碱基的差异;

欢乐时时彩 精准度高:从几个到数十万个拷贝精确计数;

不依赖已知信息:既能鉴定已知小RNA,又能发现新小RNA;

可重复性高:深度测序保证了抽样随机性,重复性非常好,无需重复实验。

研究内容

利用HiSeq平台、BGISEQ-500平台,对富集到的18-30nt的小RNA片段进行测序,对获得的有效数据进行序列长度分布统计,将筛选后的高质量序列分类注释,从而获得样品中包含的各组分及表达量信息,并对所有小RNA片段进行注释,对miRNA进行靶基因预测等分析。

一、标准分析

欢乐时时彩 1、数据产出统计,对原始信息采集数据去接头污染,去低质量reads

2、18-30 nt Small RNA 信息采集结果的长度分布

3、Small RNA在选定的参考基因组上的分布(只能选定一个参考基因组)

4、Small RNA分类注释

①Small RNA与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比对信息

欢乐时时彩 ②Small RNA与重复序列的比对信息

③Small RNA与exon/intron的比对信息

④Small RNA与miRBase中指定范围的已知的miRNA的比对

⑤miRNA家族分析

欢乐时时彩 ⑥动物保守piRNA注释分析(分析仅针对数据库中已有的物种:人、小鼠、斑马鱼、线虫、果蝇、大鼠、鸡、家蚕)

欢乐时时彩 5、Small RNA预测(miRNA/siRNA/piRNA)

6、已知和新Small RNA 定量分析(miRNA/siRNA/piRNA)

7、已知和新Small RNA差异表达分析(miRNA/siRNA/piRNA)

欢乐时时彩 8、已知和新miRNA表达/差异表达聚类分析

欢乐时时彩 9、Small RNA 靶基因预测(miRNA/siRNA/piRNA)

10、差异Small RNA 靶基因GO 注释和KEGG 通路分析

二、定制化信息分析

可结合客户的材料与需求,协商确定定制化信息分析内容。

案例

研究抗药(它莫昔芬)乳腺癌miRNA调控机制 Oncotarget, August 9, 2016

案例描述

它莫昔芬是一种治疗雌激素受体阳性乳腺癌的抗雌激素药物,但抗药性情况时常出现。为了更清晰了解这种药物抵抗分子生物学机制,此项研究选取3个在临床上出现抗它莫西芬药物的乳腺癌细胞系(TamRs)与相应的对它莫西芬药物敏感的亲本样本进行比较,研究miRNA调控机制。

部分研究成果

研究发现131个差异表达的miRNA,其中22个小RNA在所有抗药样本中都有表达,并在LNA定量PCR中得到验证。另外,发现miRNA参与调控的ESR1, PGR1, FOXM1 和14-3-3家族基因,结合研究miRNA-mRNA靶基因互作研究发现SNAI2和FYN重要基因具有重要功能,这两个基因在TamR样本中高表达,其调控miRNA呈现低表达。利用特定化学抑制剂和siRNA敲出基因实验,发现这两个基因显著性影响抗药物TamRS细胞系生长。最后,通过研究(miR-190b and miR-516a-5p)2个小RNA即可观察利用它莫西芬药物治疗抗此类药物的病人时是否出现抗药性结果,作为可能biomarker。


Small RNA,转录组研究团头鲂尾部鱼刺形成机制Scientific Reports. August 03, 2016

案例描述

肌间骨主要出现在低等的硬骨鱼的肌隔中,也是造成不容易食用的原因。为了更好了解肌间骨发育分子调控机制,此次研究采用团头鲂作为研究对象,研究肌间骨发育过程中miRNA和mRNA表达,选取发育期的4个关键时期,进行RNA高通量测序(转录组、表达谱、Small RNA测序),发现一些重要的与骨发育相关的miRNA和基因表达差异,这些miRNA和基因与TGF-β, ERK和破骨细胞发育代谢通路途径相关;同时发现不同时期miRNA-mRNA互作模式也呈现不同。miRNA-mRNA互作主要参与调解骨骼发育过程,通过双荧光素酶报告实验验证了两个miRNA呈现负调控机制。为深入了解肌间骨发育研究机制研究提供数据基础。

主要研究成果

欢乐时时彩 1、经表达谱测序研究发现,鉴定到的差异表达基因,主要参与TGF-β, ERK和破骨细胞发育等与骨发育相关代谢通路途径;

图1.四个发育阶段mRNA差异表达热图及KEGG代谢注释。

欢乐时时彩 2、四个发育时期依次比对(1-vs-S2, S2-vs-S3, S3-vs-S4, S1-vs-S3, S2-vs-S4 and S1-vs-S4)发现201, 31, 92, 219, 93 和500对miRNA-mRNA互作,其中miR-133家族调控模式与骨的形成分子机制相关。


欢乐时时彩 图2.MiRNA-mRNA互作图,(A) miR-133家族与mRNA互作网络图;(B) miRNA调控网路互作图;

3、通过qPCR验证miR-133b-3p和miR-206-3p及其靶基因表达量,与高通量测序结果一致。


欢乐时时彩 图3. qRT-PCR验证miRNA-mRNA互作模式中miRNA和mRNA表达

参考文献

[1] Joshi T, Elias D, et al. Integrative analysis of miRNA and gene expression reveals regulatory networks in tamoxifen-resistant breast cancer. Oncotarget. 2016 Aug 9.

[2] Wan, S.M. et al. Dynamic mRNA and miRNA expression analysis in response to intermuscular bone development of blunt snout bream (Megalobrama amblycephala ).  Sci.Rep. 6, 31050; doi: 10.1038/srep31050 (2016).

技术参数

一、样本要求

样品类型:真核生物、原核生物;完整且无污染的总RNA;血清血浆及FFPE样品。

样品需求量(单次):≥1 μg;血清血浆:20ng;FFPE:200ng

欢乐时时彩 样品浓度:15 ng/μL≤c≤500 ng/μL;

样品纯度:OD260/280 =1.8~2.2;OD260/230≥2.0;28S:18S≥1.5;RIN≥8.0;23S:16S≥1.5 (此项要求只针对原核生物)。

二、项目执行周期

标准流程的运转周期为30个工作日。

三、 项目合格指标

产生不低于合同规定的clean reads数。




合肥世诚生物技术有限公司

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公司技术平台特色:

分子生物学技术服务项目包括:

TA克隆,亚克隆;质粒构建,荧光定量PCR检测;RNAi干扰;miRNA检测;SNP分型;STR检测等;

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蛋白抽提,蛋白纯化,WB,Elisa,免疫组化,质谱鉴定,N端测序等。

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